激光掃描共聚焦

    這種共聚焦技術(shù)利用激光作為激發(fā)光源，將激光聚焦于樣品中的某一點(diǎn)，這樣只有該點(diǎn)附近的區(qū)域有熒光，其他沒(méi)有被激發(fā)的部位沒(méi)有熒光，這一區(qū)域發(fā)出的熒光反射到光電倍增管，在光電倍增管前設(shè)有1 個(gè)計(jì)算機(jī)控制的可調(diào)節(jié)針孔， 保證只有被激發(fā)點(diǎn)發(fā)出的熒光才能到達(dá)光電管，而附近其他點(diǎn)所發(fā)出的熒光被擋在視野之外。采用計(jì)算機(jī)控制激光和針孔， 對(duì)細(xì)胞內(nèi)的某一層面進(jìn)行掃描，可以獲得清晰的二維圖像。

    這一技術(shù)成像速度快、自動(dòng)化程度高。但激光具有單色性，一種激光器只能發(fā)出某幾個(gè)特定波長(zhǎng)的激光，而熒光染料的種類(lèi)很多，其激發(fā)光波長(zhǎng)各不相同，這樣在使用某種型號(hào)的激光器時(shí)，只有少數(shù)幾種熒光染料可以使用， 而其他大多數(shù)的染料不能使用；目前同時(shí)配備數(shù)個(gè)不同激光器或多光子脈沖激光器的激光共聚焦系統(tǒng)的出現(xiàn)，雖然可以解決這一難題，但是設(shè)備結(jié)構(gòu)復(fù)雜、價(jià)格昂貴，維護(hù)保養(yǎng)要求較高。

數(shù)字共聚焦

    這一技術(shù)是隨著計(jì)算機(jī)軟件技術(shù)的發(fā)展出現(xiàn)的，與激光共聚焦的原理有極大的區(qū)別， 它在普通的熒光顯微鏡上加上1 個(gè)計(jì)算機(jī)控制的高分辨率、帶有制冷裝置(以提高信噪比) 的CCD 攝像機(jī)， 攝像機(jī)獲取的圖像由計(jì)算機(jī)進(jìn)行解卷積(deconvolution) 計(jì)算， 這種數(shù)字式圖像處理可以將聚焦平面以外的圖形信號(hào)刪除， 保留高清晰度的焦平面信息。

    這一系統(tǒng)硬件配備比較簡(jiǎn)單，價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于激光共聚焦系統(tǒng)；由于使用可以發(fā)出連續(xù)光譜的高壓汞燈或氙燈作為光源，使這一技術(shù)幾乎可以用于所有的熒光染料，應(yīng)用范圍廣泛， 其機(jī)械部分組成簡(jiǎn)單，靈活性高。這一技術(shù)的不足在于其圖像獲取、計(jì)算對(duì)計(jì)算機(jī)的依賴(lài)性高，圖象獲取時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)除要分析的層面被激發(fā)外，細(xì)胞內(nèi)其他部位也被激發(fā)， 增加了熒光染料的光淬滅，對(duì)某些容易被光淬滅的染料會(huì)造成明顯的影響；隨著計(jì)算機(jī)和攝像技術(shù)的發(fā)展，這些問(wèn)題也在逐步解決。